Esta investigación pretende determinar si la exposición crónica a rayos X durante la práctica clínica diagnóstica, que realizan los estudiantes de Odontología como parte de su formación académica, produce daño genético. Para ello se realizaron dos bioensayos: el test de micronúcleos en células de la mucosa bucal, que evalúa efectos clastogénicos como aneugénicos y otras anormalidades del núcleo que pueden ser utilizadas como marcadores de daño celular; y el ensayo de electroforesis de células individuales o del cometa, en muestras de sangre periférica, que determina el daño a la cadena simple o a la doble cadena del ADN. Se analizaron dos cohortes, una expuesta y otra control, de estudiantes de Odontología, correspondiendo a la primera los estudiantes del último año que realizan placas radiográficas a pacientes durante un periodo de exposición crónica de tres años. La cohorte control se caracterizó por estudiantes de los primeros años de la carrera que no están expuestos a rayos X. Los resultados mostraron un aumento significativo en la frecuencia de micronúcleos (p< 0.05) y de células en apoptosis y otras anormalidades del núcleo en los estudiantes expuestos crónicamente a la radiación, pero no hubo diferencias en la medición del daño en el ADN mediante el test del cometa comparados con la población control. Los resultados permiten concluir que la dosis recibida y el tiempo de exposición a los rayos X tienen un efecto citotóxico en células de la mucosa bucal y producen un daño mínimo al ADN en células de sangre periférica.
Por D. FRANCO DE DIANA. Licenciada en Biología. Directora del Departamento de Ciencias Básicas de la Universidad Católica «Nuestra Señora de la Asunción» (deidamia_franco@uca.edu.py).
J. SEGOVIA. Licenciado en Biología. Docente investigador senior de la Universidad Católica «Nuestra Señora de la Asunción».
D. CASTIGLIONI. Licenciada en Biología. Docente investigadora senior de la Universidad Católica «Nuestra Señora de la Asunción».
C. VEGA. Doctora en Microbiología. Docente investigadora senior de la Universidad Católica «Nuestra Señora de la Asunción». Directora del Centro para el Desarrollo de las Ciencias (CEDIC).
N. LÓPEZ ACOSTA. Licenciado en Matemática Estadística. Docente técnico de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad Nacional de Asunción.
A. GÓMEZ. Máster en Ciencias Biológicas por el Centro para el Desarrollo de las Ciencias (CEDIC).
El principal efecto de las radiaciones ionizantes se produce sobre la molécula de ADN y está relacionado con las dosis y el tiempo de exposición. Si se considera que cualquier dosis, por pequeña que sea, lleva aparejado un riesgo, debe reducirse a valores tan bajos como sea posible. Sin embargo, es importante tener en cuenta el tiempo de exposición en forma crónica al que se exponen trabajadores y personas en formación profesional, como estudiantes de carrera del área de la Salud, y que la radiosensibilidad puede variar de un individuo a otro dependiendo de la edad, el sexo y el tipo de exposición[1].
La exposición a rayos X durante la radiografía panorámica en pacientes adultos y en niños induce efectos genotóxicos en células gingiviales, incrementando el exdaño cromosómico y la muerte celular. Por consiguiente, estas radiografías panorámicas dentales deberían ser solicitadas únicamente en casos muy necesarios, ya que este procedimiento no puede ser considerado como de bajo o de ningún riesgo[2].
Tolbert y colaboradores (1992 ) sugieren la utilización del test de micronúcleos como una herramienta para evaluar el efecto genotóxico, ya que se origina por roturas de cromosomas o por divisiones mitóticas anormales, así como para detectar otras anormalidades nucleares atípicas como picnosis, cariorrexis o cariolisis, que son indicadores de daño celular[4][5].
Otro ensayo útil para la detección de daño en la cadena del ADN es la electroforesis de una sola célula, o ensayo del cometa, que permite evaluar los niveles de daño en la cadena simple y doble del ADN en poblaciones celulares sin necesidad de realizar estudios de proliferación. Se trata de una herramienta potencialmente sensible para evidenciar daño genotóxico inducido por diferentes tóxicos en el sitio de acción de los mismos[6].
En Paraguay, tanto los profesionales como los estudiantes de la carrera de Odontología se exponen con frecuencia, durante las prácticas de diagnóstico por imágenes, a recibir radiaciones sin tener ningún tipo de protección, ya que este hábito de bioseguridad de radioprotección no es practicado estrictamente a este nivel, pese a la existencia de normas y legislaciones que regulan este tipo de actividad. Teniendo este hecho en cuenta, hemos procedido al análisis de micronúcleos en células de la mucosa bucal y en muestras de sangre periférica para medir el daño en el ADN mediante el test del cometa, procedentes de estudiantes de la carrera de Odontología que están expuestos de forma crónica a dosis bajas de rayos X.
Materiales y métodos
El diseño de la investigación corresponde a un estudio observacional analítico de corte transversal, de cohortes de expuestos y no expuestos, a quienes se le aplicó una encuesta para evaluar el estado de salud, hábitos de fumar, de consumo de alcohol y de drogas, tiempo de exposición y métodos de radioprotección durante la realización de placas radiográficas.
Población expuesta
Alumnos sin distinción de sexos con edades comprendidas entre 24 y 29 años, que cursaban materias clínicas de la carrera de Odontología y que estuvieron expuestos a radiaciones ionizantes causadas por la toma de radiografías a pacientes de la clínica odontológica, durante por lo menos tres años.
Población no expuesta
Estudiantes de la carrera de Odontología, del ciclo básico, que no hayan estado expuestos a rayos X por la toma de radiografías.
Técnicas de instrumentos de recolección de datos
Análisis genótoxico
Se evaluó el efecto genotóxico mediante dos bioensayos: el test de micronúcleos en células de la mucosa bucal y el ensayo del cometa.
Las muestras de mucosa bucal y de sangre periférica de cada individuo, tanto de la población control como de la expuesta, se tomaron en forma simultánea durante los meses de junio a octubre.
Análisis de micronúcleos en células exfoliadas de mucosa bucal
Se evaluó si la exposición crónica a rayos X durante la práctica clínica diagnóstica, que realizan los estudiantes de Odontología como parte de su formación académica, produce daño genético
Se obtuvo una muestra de células de la mucosa bucal mediante un raspado de la cara interna de la mejilla con un bajalengua, con el cual se realizó un extendido en la lámina portaobjeto. Las muestras fueron fijadas con metanol / ac. acético (3:1) y se colorearon con la técnica de Feulgen. La observación al microscopio se realizó mediante la utilización de filtros especiales para contrastar el citoplasma. Se contaron 2.000 células por individuo y se determinó la frecuencia de micronúcleos en ambas poblaciones, la control y la expuesta, según Tolbert (1992)[7] y Fenech(1999)[8].
Test del cometa para medir daño en el ADN
La técnica del test del cometa se realizó según Singh et al. (1988) y con pequeñas modificaciones[9] y consideraciones de optimización[10]. Se obtuvieron 2 μl de sangre periférica del dedo anular de cada uno de los participantes. Las muestras fueron suspendidas en 0,5% de agarosa de bajo punto de fusión (LMP) y pipeteadas en portaobjetos que previamente fueron cubiertos con una capa de agarosa de punto de fusión normal (NMP) al 1% y llevados a 4°C durante 10 minutos; luego se sumergieron en buffer de lisis (2,5M Nacl, 100 μm Na2EDTA, 10 μm Tris- Hcl Ph 10,1, Triton – X – 100 y 10 % DMSO) durante una hora a 4°C en oscuridad, a los efectos de provocar la lisis y la descompactación del ADN. Posteriormente, los portaobjetos fueron expuestos a bufferalcalino (1 mM Na2EDTA, 300mM NAOH buffer) Ph >13 durante 20 minutos para degradar el ADN.
Para el efecto se desarrollaron dos bioensayos: el test de micronúcleos, en células de la mucosa bucal, y el ensayo de electroforesis de células individuales o del cometa, en muestras de sangre periférica
Cada portaobjetos fue sometido a electroforesis durante 20 minutos a 25 V y 300 m A, en el mismo buffer, y posteriormente se lavaron con buffer 0,4 Try-Hcl (Ph 7, 5) para eliminar el exceso de álcali y remover los detergentes. La fijación de las muestras se realizó con alcohol p.a y las láminas finalmente fueron teñidas con bromuro de etidio (10 μg/ml). Se examinaron las láminas bajo microscopio de fluorescencia con un aumento de 400 x .
Se evaluaron 100 células por placa mediante registro visual y a través del software Casp Lab Comet Assay free.
Evaluación por registro visual
Se realizó según los criterios de Speit (1995)[12] y Collins (2004)[13] , donde las células se clasifican considerando que a mayor descarga de ADN polifragmentado fuera del núcleo, mayor es el daño genotoxico. Para cuantificar el daño al ADN se establece una categoría de daño a las células basadas en el largo del cometa:
- Categoría 0: células sin daño (5 μm).
- Categoría I: células con bajo nivel de daño (5-20 μm).
- Categoría II: células con medio nivel de daño (entre 20 y 40 μm).
- Categoría III: células con alto nivel de daño (entre 40 y 95 μm).
- Categoría IV: células totalmente dañadas (superior a 95 μm).
Una vez establecido el porcentaje de células en cada categoría se calculó el índice de daño (N) por cada muestra de individuo:
N= N° Cél Cat I + 2XN° Cél.Cat II + 3XN° Cél. Cat III + 4 X N° de Cel. Cat IV
Evaluación por el ‘software’ Casp Lab Comet Assay IV
Se obtuvieron valores de momento de la cola (tail moment), que permiten medir el porcentaje de ADN en la cola del cometa, y momento olive (tail moment olive), que describe la heterogeneidad de la respuesta dentro de una población celular, ya que calcula las variaciones de la distribución de ADN dentro de la cola, midiéndolas en μm.
Análisis estadístico
Para el análisis exploratorio de los datos de micronúcleos en células de la mucosa bucal para el grupo de control (n=31) y el grupo expuestos (n=30) se utilizó el paquete estadístico SPSS. Los resultados fueron analizados estadísticamente mediante la prueba «t» de Student y se aplicó, además, la prueba no paranéfrica U de Mann-Whitney para el contraste de hipótesis.
El análisis de daño en el ADN con el ensayo del cometa se llevó a cabo mediante la prueba de comparación de medias U de Mann-Whitney para dos muestras independientes de los datos de daño en el ADN y valores del momento de la cola (tail moment) y momento olive (tail moment olive).
Resultados
Caracterización demográfica de las poblaciones estudiadas
Población control o no expuesta
Alumnos estudiantes de Odontología, de edades comprendidas entre 18 y 20 años, cursando el primer año de la carrera. El 84% de la población es femenina (25/31) y el 16% (5/31) masculina.
El 43,3% (13/30) de la población presenta antecedentes familiares con algún tipo de cáncer, ya sea de pulmón, próstata, útero y, mayoritariamente, mama. El 40% de la población analizada es consumidora casual de alcohol.
Población expuesta
La población expuesta consiste en 30 estudiantes de Odontología que actualmente cursan el sexto año de la carrera. Sus edades están comprendidas entre 23 y 29 años, el 83% de la población es femenina (25/30) y el 17% (5/30) es masculina. El 56,7% de la población analizada es consumidora de alcohol de forma moderada.
El 26,7% (8/30) de la población presenta antecedentes familiares con algún tipo de cáncer, ya sea de huesos, próstata, mama y, mayoritariamente, colon. Todos los estudiantes encuestados señalaron que trabajan desde hace al menos tres años en la sala de rayos X; el cien por cien de los encuestados no utiliza ningún tipo de protección contra los rayos X .
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